熒光抑制
目前，抑制熒光干擾的方法有如下幾種：
一種簡(jiǎn)單的方法是加入熒光猝滅劑。但是使用這種方法的時(shí)候必須要保證樣品不會(huì)受到高濃度的熒光猝滅劑干擾，對(duì)于生物樣品來說，這基本不可能。
另一種方法是使用比低能量吸收帶更長(zhǎng)的波長(zhǎng)激光來激發(fā)樣品（預(yù)共振激發(fā)）。利用這一思想的一項(xiàng)重要技術(shù)就是傅里葉變換（FT）拉曼光譜。在很多情況下，用這種方式可以獲得在高熒光中的拉曼光譜信號(hào)，但是這種方法有一些嚴(yán)重的缺陷。首先，這種激發(fā)光不會(huì)直接與任何的基團(tuán)發(fā)生共振，在多組分樣本中就不能實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基團(tuán)的選擇性增強(qiáng)。其次，由于激發(fā)光受限于預(yù)激發(fā)波長(zhǎng)，就不能通過吸收帶來測(cè)量共振拉曼激發(fā)的輪廓曲線（拉曼強(qiáng)度是激發(fā)波長(zhǎng)的函數(shù)）。這是一個(gè)極其嚴(yán)重的缺陷，因?yàn)榉治黾ぐl(fā)光的輪廓曲線對(duì)于探測(cè)色團(tuán)的激發(fā)電子狀態(tài)特性是很有用的。
還有一種方法是基于拉曼散射和熒光發(fā)射可以在時(shí)間上區(qū)分開來，使用門控和時(shí)間相關(guān)的光子計(jì)數(shù)來提供時(shí)間分辨率。該方法涉及到激光強(qiáng)度的高頻率調(diào)制，不止是激光器的鎖模，還用到了外部的調(diào)制器來調(diào)制激光腔，但是僅在熒光壽命相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)候才有用。
另一種區(qū)分拉曼信號(hào)和熒光背景的方法是設(shè)計(jì)激發(fā)激光的波長(zhǎng)調(diào)諧。這種技術(shù)通過向一個(gè)連續(xù)波染料激光器的調(diào)諧元件中引入一個(gè)低頻調(diào)制器而得以實(shí)現(xiàn)。波長(zhǎng)調(diào)制技術(shù)可應(yīng)用于任何系統(tǒng)，但其用途受限于對(duì)激光波長(zhǎng)的低頻調(diào)制和鎖定檢測(cè)的專用設(shè)備。
上述的各種熒光消除技術(shù)方法確實(shí)發(fā)揮了一定作用，但是它們的劣勢(shì)也是顯而易見。
位移差分拉曼光譜
根據(jù)Kasha's rule，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的研究人員提出了位移差分拉曼方法來解決熒光背景干擾的問題。分子所發(fā)射的光（熒光或磷光）只能從某一多重態(tài)中的低態(tài)激發(fā)，因此對(duì)于激發(fā)光的微小偏移并不影響背景（樣品受激發(fā)射光譜）。獲得的拉曼光譜的熒光輪廓幾乎不發(fā)生變化。而拉曼光譜作為散射光譜特征峰出現(xiàn)的位置與激發(fā)光源頻譜位置有固定關(guān)系，當(dāng)激發(fā)光頻率移動(dòng)時(shí)拉曼特征峰會(huì)跟著移動(dòng)。Johannes Kiefer在文章中用寬譜光源進(jìn)行光譜成像，很形象的說明了這一現(xiàn)象。圖中y代表不同激發(fā)頻率，顏色譜代表了接收到的光譜強(qiáng)度。對(duì)比下面的光譜圖，可以看中間有很強(qiáng)的一片區(qū)域是中心對(duì)稱的，代表了不隨激發(fā)光頻率變化的受激發(fā)射光譜，而窄窄的傾斜光譜則是拉曼光譜。
位移差分拉曼光譜（SERDS），這種技術(shù)基于在兩個(gè)有輕微偏移的激發(fā)激光中收集兩張不同的光譜。首先，與以前的技術(shù)對(duì)比，不需要使用特殊的設(shè)備來改變激勵(lì)激光器的波長(zhǎng)。其次，使用多通道檢測(cè)，從而在給定的信號(hào)積分時(shí)間內(nèi)改善了信噪比。對(duì)于現(xiàn)在的制冷式非加強(qiáng)CCD探測(cè)器，具有非常高的散粒噪聲，信噪比對(duì)于這種可以簡(jiǎn)單實(shí)現(xiàn)的差分方法是至關(guān)重要的。除了這些特性以外，這種方法對(duì)于短壽命的和長(zhǎng)壽命的熒光樣品同樣適用。
差分拉曼技術(shù)采用物理和數(shù)學(xué)相結(jié)合的熒光處理方法，常規(guī)流程如下：
首先，需要獲得采用具有已知微小波長(zhǎng)錯(cuò)位的光源激發(fā)的拉曼光譜。將光譜的基線對(duì)齊，理論上對(duì)齊后光譜相減生成的曲線中僅包含拉曼光譜的差分信息。根據(jù)公式：
可以將差分曲線看作拉曼光譜橫軸顛倒后與兩個(gè)δ函數(shù)差的卷積： 
可以對(duì)差分曲線積分后，看作拉曼光譜與一個(gè)方波函數(shù)的卷積，通過解卷積的方式獲得真實(shí)拉曼光譜。
實(shí)際操作中雖然兩次差分光譜雖然相差不大，但是由于激光的漂白作用或激光的波動(dòng)，焦點(diǎn)位置的微小變化等各種因素都可能導(dǎo)致光譜曲線的變化。錯(cuò)誤的對(duì)齊將在差分拉曼光譜重建過程中被放大，降低拉曼特征提取效果。數(shù)學(xué)操作上，光譜對(duì)齊像一個(gè)悖論。我們希望通過光譜對(duì)齊通過差分扣除光譜中的熒光部分，分離熒光和拉曼信號(hào)；但是只有我們知道準(zhǔn)確的熒光才可能讓光譜熒光的對(duì)齊。而如果我們已經(jīng)可以清楚的區(qū)分熒光和拉曼信號(hào)，我們則沒有必要對(duì)光譜信號(hào)進(jìn)行差分。
為了解決這一問題，常規(guī)做法是近似，根據(jù)整個(gè)光譜面積或關(guān)鍵的局部面積作為基準(zhǔn)對(duì)譜圖進(jìn)行縮放和平移，使譜圖的匹配基本匹配。然后再對(duì)差分后產(chǎn)生的曲線進(jìn)行矯正，如交替小二乘法（ALS）擬合。但是由于擬合目標(biāo)是未知的，所以該方法還存在很多不確定性。
申貝開發(fā)團(tuán)隊(duì)采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)，基于任意函數(shù)可以被一個(gè)有三層單元的網(wǎng)絡(luò)以任意精度逼近(Cybenko 1988)這一原理。通過迭代優(yōu)解的方式，同時(shí)將差分、對(duì)齊和基線矯正同時(shí)完成。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過幾十次迭代（用時(shí)0.2s）可以準(zhǔn)確分離差分信號(hào)和基線偏差。
目前，位移差分拉曼光譜的應(yīng)用場(chǎng)景也在積極開發(fā)中。
德國(guó)Ferdinand Braun研究所的研究人員在瑞士的一個(gè)蘋果園采用位移差分拉曼光譜技術(shù)，克服室外背景陽(yáng)光以及樣品熒光干擾，就蘋果皮和蘋果樹葉進(jìn)行了SERDS測(cè)量，獲得了蘋果的指紋特征。該團(tuán)隊(duì)還基于差分拉曼技術(shù)進(jìn)行了針對(duì)人體健康的人體皮膚中胡蘿卜素的檢測(cè)研究，實(shí)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)樣品0.05nmol/g的檢出限。
針對(duì)紅酒中酒精和甲醇的檢測(cè)，眾所周知紅酒具有很高的熒光信號(hào)，美國(guó)和克羅地亞研究人員，通過位移激發(fā)差分拉曼技術(shù)在譜圖中恢復(fù)了葡萄酒中乙醇和甲醇的光譜，通過400次平均實(shí)現(xiàn)對(duì)含量在0.05%甲醇的檢測(cè)。
申貝開發(fā)團(tuán)隊(duì)采用785nm，間距1nm的差分拉曼系統(tǒng)，結(jié)合團(tuán)隊(duì)開發(fā)的差分拉曼解調(diào)和去噪算法，對(duì)弱激發(fā)下的樣品拉曼特征也進(jìn)行了相關(guān)研究。
科技開發(fā)的目的絕不僅僅是技術(shù)的更新升級(jí)，如何能將技術(shù)應(yīng)用與市場(chǎng)熱點(diǎn)需求深入結(jié)合，將科技成果轉(zhuǎn)換為社會(huì)生產(chǎn)力才是關(guān)鍵。Senbe開發(fā)團(tuán)隊(duì)推出的位移差分拉曼光譜技術(shù)新品突破性的解決了拉曼光譜熒光干擾的問題，進(jìn)一步優(yōu)化和完善了拉曼光譜快檢性能，拓寬了拉曼光譜的研究和應(yīng)用領(lǐng)域，對(duì)促進(jìn)拉曼光譜領(lǐng)域的科學(xué)技術(shù)與理論發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)。期待Senbe開發(fā)團(tuán)隊(duì)以及更多的拉曼領(lǐng)域科研工作者通過不懈的努力去探索和發(fā)展位移差分拉曼光譜這一新興技術(shù)，將**的拉曼光譜技術(shù)轉(zhuǎn)化為科技成果并投入規(guī)模化生產(chǎn)，讓便攜式拉曼檢測(cè)技術(shù)變得更為實(shí)用和方便。
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